骨質(zhì)疏松癥是以骨組織顯微結(jié)構(gòu)受損，骨礦成分和骨基質(zhì)等比例不斷減少，骨質(zhì)變薄，骨小梁數(shù)量減少，骨脆性增加和骨折危險(xiǎn)度升高的一種全身骨代謝障礙的疾病。其主要臨床表現(xiàn)為骨痛及腰背痛、駝背、易發(fā)骨折等，其中以原發(fā)性骨質(zhì)疏松癥最常見(jiàn)。因骨質(zhì)疏松癥引發(fā)的骨折及其并發(fā)癥是老年人致殘和致死的重要原因。隨著進(jìn)入老齡化社會(huì)，骨質(zhì)疏松癥病人逐年增加。以髖部骨折為例，每年全球約有450萬(wàn)患者，其中50%的病人屬于亞洲國(guó)家，因此骨質(zhì)疏松癥將是一個(gè)嚴(yán)峻的公共衛(wèi)生問(wèn)題，對(duì)骨質(zhì)疏松的防治研究具有重要的醫(yī)學(xué)和社會(huì)學(xué)意義。

酪蛋白激酶2相互作用蛋白(CKIP-1) 是近年被發(fā)現(xiàn)的一種新型凋亡因子，研究表明其在骨質(zhì)疏松成骨過(guò)程中起到重要作用，是骨形成負(fù)調(diào)控因子。本文綜述了CKIP-1與骨質(zhì)疏松癥的關(guān)系。

1.CKIP-1結(jié)構(gòu)和特性

CKIP-1是在研究酪蛋白激酶2( CK2)的過(guò)程中發(fā)現(xiàn)的。CK2存在于所有的真核細(xì)胞中，CK2在不同物種中具有高度保守性，具有重要的生物學(xué)功能，參與包括轉(zhuǎn)錄、翻譯、形態(tài)發(fā)生及細(xì)胞周期調(diào)控在內(nèi)的許多生物學(xué)過(guò)程。CK2是一個(gè)四聚體ser /thr蛋白激酶，具有兩個(gè)調(diào)控亞基( β2)，兩個(gè)催化亞基( α和α1)。研究發(fā)現(xiàn)，CK2的兩個(gè)催化亞基具有功能的特異性，如CK2α1與控制細(xì)胞的增殖和存活有關(guān)。因此，在用酵母雙雜交技術(shù)鑒定與CK2相互作用的蛋白質(zhì)時(shí)，發(fā)現(xiàn)了一種新型的CK2相互作用蛋白: CKIP-1能與CK2α相互作用，但不能與CK2α1相互作用。后來(lái)人們又通過(guò)實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)CKIP-1在體外條件下不能改變CK2激酶的活性，CK2也不能改變CKIP-1蛋白的磷酸化水平，所以推測(cè)CKIP-1既不是CK2的直接調(diào)控因子，也不是CK2的底物，而認(rèn)為是CKIP-1的一種非酶活性的間接調(diào)控因子，它通過(guò)調(diào)節(jié)CK2的亞細(xì)胞定位發(fā)揮對(duì)CK2功能的調(diào)控作用。全長(zhǎng)的CKIP-1 cDNA編碼有409個(gè)氨基酸，分子量約為46kD。其蛋白質(zhì)分子的N端包含一個(gè)PH結(jié)構(gòu)域，它與CKIP-1的質(zhì)膜定位密切相關(guān)，還參與CKIP-1與其他蛋白質(zhì)的相互作用(如與CK2的相互作用)?？梢院?span lang="EN-US">Akt發(fā)生相互作用，抑制腫瘤的增殖。CKIP-1的C末端結(jié)構(gòu)域可以通過(guò)caspase-3切割的方式被釋放，結(jié)合并調(diào)控C-Jun /AP-1的轉(zhuǎn)錄因子活性，促進(jìn)腫瘤細(xì)胞凋亡。CKIP-1可以招募ATM到質(zhì)膜定位，為毛細(xì)血管擴(kuò)張性共濟(jì)失調(diào)綜合征(ATS)病人來(lái)源細(xì)胞的質(zhì)膜異常表達(dá)提供分子機(jī)制; CKIP-1可被IFNγ和IL-2誘導(dǎo)表達(dá)，通過(guò)與IFP35和Nmi的相互作用，防止細(xì)胞因子應(yīng)答過(guò)度; CKIP-1的PH 結(jié)構(gòu)域具有核定位信號(hào)的功能，提示CKIP-1的N端PH結(jié)構(gòu)域的核定位信號(hào)與C端PH抑制信號(hào)之間的協(xié)調(diào)作用在調(diào)控CKIP-1亞細(xì)胞定位中的決定作用。

CKIP-1是一種沒(méi)有酶活性的調(diào)控蛋白，但是它具有許多參與蛋白質(zhì)-蛋白質(zhì)相互作用、蛋白質(zhì)-脂質(zhì)相關(guān)互作用的結(jié)構(gòu)域或模體，具有非常重要的生物學(xué)功能。CKIP-1通過(guò)與其他蛋白質(zhì)或脂質(zhì)的相互作用，可能在介導(dǎo)細(xì)胞質(zhì)與細(xì)胞核之間的信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)中起到重要作用，它通過(guò)自身亞細(xì)胞的定位調(diào)節(jié)其他分子的亞細(xì)胞定位從而對(duì)其功能進(jìn)行調(diào)控，在癌變、凋亡在內(nèi)的許多細(xì)胞行為中發(fā)揮著重要的作用。研究表明CKIP-1通過(guò)Smurf1介導(dǎo)的泛素-蛋白酶體調(diào)控成骨過(guò)程，發(fā)揮重要的負(fù)調(diào)控作用。

2.CKIP-1成骨抑制作用

泛素-蛋白酶系統(tǒng)是真核細(xì)胞中蛋白質(zhì)降解的主要途徑。發(fā)現(xiàn)這一途徑的3位科學(xué)家在2004年被授予諾貝爾化學(xué)獎(jiǎng)。泛素(Ub)是由76個(gè)氨基酸組成的極為保守的蛋白。泛素化修飾是一種常見(jiàn)的蛋白質(zhì)修飾，廣泛參與蛋白質(zhì)的降解，細(xì)胞的吞噬作用，跨膜蛋白的分類(lèi)與轉(zhuǎn)運(yùn)，DNA的修復(fù)等細(xì)胞生物學(xué)過(guò)程。在泛素化過(guò)程中有3種酶介導(dǎo)了這一過(guò)程，它們是泛素活化酶( E1)、泛素結(jié)合酶( E2)和泛素連接酶( E3)。E3可以促進(jìn)單泛素或多泛素轉(zhuǎn)運(yùn)到底物上。Smurf1 屬于E3泛素連接酶家族。泛素標(biāo)記需要被降解的蛋白質(zhì)，繼而使被標(biāo)記的蛋白在蛋白酶體中被降解。E3泛素連接酶主要負(fù)責(zé)特異性識(shí)別靶蛋白底物。Smurf1主要通過(guò)與Smad1、5作用，引發(fā)Smad蛋白及與它們相互作用的蛋白質(zhì)的泛素化和降解。Smurf1含有1個(gè)HECT結(jié)構(gòu)域和2個(gè)WW結(jié)構(gòu)域。在HECT結(jié)構(gòu)域的羧基端有一個(gè)高度保守的半胱氨酸殘基，該半胱氨酸與泛素之間可形成硫酯鍵，一旦將這個(gè)高度保守的半胱氨酸殘基突變?yōu)楸彼峄蚋拾彼岷螅?span lang="EN-US">Smurf1便完全喪失其泛素化和降解特定蛋白質(zhì)的活性。WW結(jié)構(gòu)域是Smurf1的另一個(gè)重要特征，定位于其第236到311位氨基酸之間，含有大約30個(gè)氨基酸，其中包含高度保守的2個(gè)色氨酸和1個(gè)脯氨酸，具有與富含脯氨酸的小肽( PPXY結(jié)構(gòu))相結(jié)合的能力。

Smurf1介導(dǎo)BMP受體的降解，骨形態(tài)發(fā)生蛋白(BMP)是一類(lèi)具有多種功能的分泌型細(xì)胞生長(zhǎng)因子，屬于TGF-β超家族的成員。經(jīng)典的BMP信號(hào)通路由BMP配體、BMP特異性受體、Smads信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)蛋白等組成，Smurf1通過(guò)介導(dǎo)BMP I型受體的降解，影響BMP /BMPR I s /BMPR-ⅡS三聚體的形成，進(jìn)而從起始抑制BMP信號(hào)通路的下傳。Smurf1同Smad6 /7在細(xì)胞核內(nèi)結(jié)合，然后共同出核被運(yùn)送到細(xì)胞膜上引發(fā)BMP I型受體的降解。Murakami等發(fā)現(xiàn)，僅有Smad6 /7或者Smurf1降解BMP I 型受體的能力大為下降，提示這種降解功能是由兩者形成的復(fù)合物共同完成的。

Smurf1介導(dǎo)Smad1和Smad5蛋白的降解: 早期在非洲蟾蜍胚胎中證實(shí)Smurf1可以介導(dǎo)Smad1的降解。Zhao等通過(guò)檢測(cè)成骨細(xì)胞中Smurf1對(duì)Smad1降解的介導(dǎo)作用，發(fā)現(xiàn)在成肌/成骨前體細(xì)胞C2C12細(xì)胞系中，Smurf1可以劑量依賴(lài)性地介導(dǎo)Smad1的降解，并且Smurf1介導(dǎo)Smad1的降解是以一種蛋白酶體依賴(lài)性的方式進(jìn)行的。研究發(fā)現(xiàn)，一旦Smurf1的催化位點(diǎn)發(fā)生突變，其對(duì)Smad1的降解作用將明顯變?nèi)酢Ｍ瑫r(shí)蛋白酶體抑制劑可以劑量依賴(lài)性地逆轉(zhuǎn)Smurf1對(duì)Srnad1的降解作用。許多不同的蛋白酶體抑制劑也可以增強(qiáng)內(nèi)源性Smad1蛋白的水平。Ying等通過(guò)在C2C12細(xì)胞系中過(guò)表達(dá)Smurf1發(fā)現(xiàn)Smad5蛋白的水平明顯降低，并且這種降低可以被乳胞素(一種蛋白酶體抑制劑) 逆轉(zhuǎn)，通過(guò)ＲNA干擾技術(shù)沉默C2C12細(xì)胞內(nèi)源性的Smurf1后，Smad5蛋白的水平明顯上升。Smurf1 介導(dǎo)轉(zhuǎn)錄因子Ｒunx2 蛋白的降解:Runxs是新發(fā)現(xiàn)的一類(lèi)調(diào)控間充質(zhì)干細(xì)胞向成骨方向分化的特異性轉(zhuǎn)錄因子，包括Runx1、2、3。Runx2通常也稱(chēng)作Cbfal(核結(jié)合因子)，其作為BMP-2的靶基因，是成骨細(xì)胞分化、骨發(fā)育的重要調(diào)節(jié)因子，在成骨細(xì)胞分化過(guò)程中起著重要作用。Runx2在BMP信號(hào)通路中同Smad1蛋白結(jié)合形成一種復(fù)合物，共同激活下游靶基因的表達(dá)。由于轉(zhuǎn)錄因子Runx2蛋白結(jié)構(gòu)中含有Smurf1可識(shí)別的PY 結(jié)構(gòu)，Zhao等研究了Smurf1在C2C12和成骨前體細(xì)胞系2T3中對(duì)RuNX2蛋白降解的介導(dǎo)作用，通過(guò)免疫共沉淀實(shí)驗(yàn)證實(shí)了Smurf1蛋白和Runx2蛋白之間的相互作用。Smurf1可以劑量依賴(lài)性地降低細(xì)胞中原本十分穩(wěn)定表達(dá)的Runx2蛋白水平，并且這種降解現(xiàn)象是蛋白酶體依賴(lài)性的Smad6在與Runx2結(jié)合的過(guò)程中，可以增強(qiáng)這一降解作用。

CKIP-1可以作為Smurf1的激活因子，在Smurf1介導(dǎo)的泛素-蛋白酶體降解途徑中發(fā)揮功能。Smurf1作為泛素連接酶可以降解多種蛋白，包括Smad1/5、TGF-β受體、BMP受體、骨特異性轉(zhuǎn)錄因子Runx2以及磷酸化形式的MEKK2等，從而負(fù)調(diào)控骨形成。CKIP-1的C末端結(jié)構(gòu)域可以與Smurf1兩個(gè)WW結(jié)構(gòu)域之間的連接區(qū)發(fā)生相互作用，增強(qiáng)Smurf1 的泛素連接酶活性。CKIP-1基因敲除的小鼠表現(xiàn)出與Smurf1基因敲除小鼠相似的表型，即骨量的上升和骨形成速率的增強(qiáng)。同時(shí)，CKIP-1還可以結(jié)合蛋白酶體亞基Ｒpt6，作為接頭蛋白偶聯(lián)Smurf1與蛋白酶體，增強(qiáng)泛素化蛋白底物的降解，CKIP-1在Smurf1與底物的相互作用以及底物招募至26S蛋白酶體的過(guò)程中發(fā)揮雙重作用。綜上，CKIP-1作為Smurf1的增強(qiáng)性因子，可以通過(guò)調(diào)控Smurf1的泛素連接酶活性來(lái)影響骨量，CKIP-1作為生理?xiàng)l件下的骨形成負(fù)調(diào)控因子，有望成為新的治療骨質(zhì)疏松的藥物靶點(diǎn)。見(jiàn)圖1。

圖1  CKIP-1 與相互作用蛋白的結(jié)合區(qū)域

3.CKIP-1 在骨質(zhì)疏松治療中的地位

骨骼形成之后，終生都處于由成骨細(xì)胞控制的骨形成和破骨細(xì)胞控制的骨吸收共同調(diào)控的重塑過(guò)程之下。這種重塑過(guò)程中的平衡一旦被打破，就會(huì)導(dǎo)致骨骼系統(tǒng)出現(xiàn)異常，進(jìn)而引起骨病的發(fā)生。成骨細(xì)胞和破骨細(xì)胞共同維持著成骨的穩(wěn)態(tài)，二者的功能相反，而且二者的來(lái)源也截然不同，成骨細(xì)胞是由間充質(zhì)干細(xì)胞分化而來(lái)，而破骨細(xì)胞則是由骨髓中的單核/巨噬細(xì)胞前體細(xì)胞分化而來(lái)。過(guò)去10多年的研究大大豐富了人們對(duì)破骨細(xì)胞分化及功能調(diào)控的分子機(jī)制的了解，其中突破性的研究進(jìn)展是RANKL/RANK/OPG信號(hào)通路的發(fā)現(xiàn)和破骨細(xì)胞體外誘導(dǎo)培養(yǎng)技術(shù)的建立，目前破骨細(xì)胞已成為重要的藥靶，但是以破骨作為藥靶的骨質(zhì)疏松治療藥物有一個(gè)明顯缺陷，即其只能降低骨吸收的速率，并不能刺激重癥骨質(zhì)疏松患者的新骨形成。Lu等證實(shí)破骨相關(guān)的標(biāo)志物分子在血清中檢測(cè)沒(méi)有發(fā)現(xiàn)差別，用長(zhǎng)骨組織的ＲNA檢測(cè)也沒(méi)有發(fā)現(xiàn)破骨細(xì)胞相關(guān)的標(biāo)志物基因轉(zhuǎn)錄水平的變化，并且Smurf1在破骨細(xì)胞中不表達(dá)，提示CKIP-1可能不影響破骨細(xì)胞的功能。

相對(duì)而言，對(duì)控制成骨細(xì)胞分化的基因了解較少，基于成骨細(xì)胞功能研究的藥物研發(fā)報(bào)道非常有限。目前研究證實(shí)以成骨細(xì)胞分化特異轉(zhuǎn)錄因子Runx2為代表的一系列轉(zhuǎn)錄因子和信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)分子在發(fā)育早期成骨細(xì)胞介導(dǎo)的骨形成中發(fā)揮重要作用。這些敲除小鼠往往表現(xiàn)為出生時(shí)骨骼發(fā)育缺陷(如Runx2)。這些對(duì)胚胎期骨發(fā)育具有重要作用的基因往往因?yàn)楦弊饔么蠖y以成為藥物靶標(biāo)。對(duì)于骨病來(lái)說(shuō)，其主要發(fā)病人群表現(xiàn)為骨質(zhì)疏松。中老年發(fā)病居多，在絕經(jīng)期后的婦女中表現(xiàn)尤為嚴(yán)重?，F(xiàn)在僅僅發(fā)現(xiàn)了幾個(gè)分子影響了成體內(nèi)成骨細(xì)胞的功能(Stat1、LRP5、Tob、Shn3、Smurf1)，而對(duì)這些基因和信號(hào)通路的深入研究有可能找到促進(jìn)成骨細(xì)胞活性使骨形成增加，從而有效治療骨質(zhì)疏松這種老年病的方法。最新研究表明CKIP-1影響了體內(nèi)成骨細(xì)胞的功能。CKIP-1敲除小鼠的骨量升高隨著年齡的增大而更加顯著，這種小鼠對(duì)于體內(nèi)成骨細(xì)胞調(diào)控機(jī)制的研究可以起到很好的推動(dòng)作用。同時(shí)提示CKIP-1 有可能成為理想的藥物靶標(biāo)。

4.CKIP-1尚待解決的疑問(wèn)

CKIP-1是影響了全身的骨量還是部分骨量?骨的形成分為兩類(lèi)，膜內(nèi)成骨和骨內(nèi)成骨，而對(duì)于長(zhǎng)骨來(lái)說(shuō)又分為皮質(zhì)骨和松質(zhì)骨，那么CKIP-1對(duì)骨骼系統(tǒng)的影響是廣譜性的還是特異性的? 部分研究顯示與野生型小鼠相比，CKIP-1敲除的小鼠表現(xiàn)的骨量升高在頂骨、尾椎骨和股骨處尤為顯著。

CKIP-1是否參與間充質(zhì)干細(xì)胞的分化? CKIP-1的缺失可以增強(qiáng)成骨細(xì)胞的分化能力，而成骨細(xì)胞是由來(lái)源于中胚層的間充質(zhì)干細(xì)胞分化而來(lái)，小鼠的間充質(zhì)干細(xì)胞具有四系分化能力，可以分化為成骨細(xì)胞、成肌細(xì)胞、軟骨細(xì)胞和脂肪細(xì)胞。那么CKIP-1敲除的小鼠其間充質(zhì)干細(xì)胞分化能力是不是也得到了增強(qiáng)? 如果是，那么其影響了間充質(zhì)干細(xì)胞的某一譜系分化還是四系分化能力? 對(duì)骨骼系統(tǒng)的分析發(fā)現(xiàn)，CKIP-1敲除小鼠與野生型相比，骨形態(tài)學(xué)上沒(méi)有明顯差異，提示可能沒(méi)有影響軟骨細(xì)胞的分化; 對(duì)脂肪組織的HE染色結(jié)果發(fā)現(xiàn)脂肪細(xì)胞形態(tài)上沒(méi)有明顯差別，但是否影響了兩者的功能及影響了成肌細(xì)胞的分化，目前還沒(méi)有相關(guān)報(bào)道。

CKIP-1在骨骼系統(tǒng)所發(fā)揮的作用對(duì)Smurf1的依賴(lài)程度有多大? 目前的研究仍然不能排除CKIP-1可以通過(guò)不調(diào)控Smurf1的通路影響成骨細(xì)胞，目前的數(shù)據(jù)只是證明在CKIP-1缺失的條件下Smurf1的活性確實(shí)受到了削弱，但是CKIP-1敲除小鼠骨量升高的表型是單獨(dú)由于Smurf1活性降低導(dǎo)致還是包括Smurf1 在內(nèi)的多個(gè)分子協(xié)同調(diào)節(jié)?

5.結(jié)語(yǔ)

CKIP-1是一種沒(méi)有酶活性的調(diào)控蛋白，但是它具有許多參與蛋白質(zhì)-蛋白質(zhì)相互作用、蛋白質(zhì)-脂質(zhì)相互作用的結(jié)構(gòu)域或摸體，還有許多潛在的磷酸化位點(diǎn)，因此它具有非常重要的生物學(xué)功能。CKIP-1通過(guò)與其他蛋白質(zhì)或脂質(zhì)的相互作用，可能在介導(dǎo)細(xì)胞質(zhì)與細(xì)胞核之間的信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)中起到重要作用，它通過(guò)自身亞細(xì)胞的定位調(diào)節(jié)其他分子的亞細(xì)胞定位從而對(duì)其功能進(jìn)行調(diào)控，在骨骼正常生理活動(dòng)中起著至關(guān)重要的作用，并與多種骨疾病密切相關(guān)。因此，CKIP-1不僅是研究骨代謝、骨質(zhì)疏松的關(guān)鍵，而且已成為骨質(zhì)疏松治療的靶點(diǎn)。

(來(lái)源：胡炯,中國(guó)骨質(zhì)疏松雜志)